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Post by alamin4470 on Aug 13, 2023 5:40:25 GMT -5
胞 将锌指核酸酶处理的细胞以 1 个细胞/孔铺在 10 个涂有胶原蛋白 I 的 96 孔板中(BD,Franklin Lakes,新泽西州,美国)。14 天后,单细胞克隆变得明显。将细胞扩增至48孔板。收获一些细胞用于突变筛选。使用 ZFN-CMAH 正向引物 (5' GGACCTGGCTTTATCTTGCTCGC 3') 和 ZFN-CMAH 反向引物 (5' CCATACTTGTCTGCTGGGTGGG 3') 进行 PCR。筛选的更多细节如图 S1 所示。PCR 产物在 0.8% 琼脂糖凝胶上解析,并 通过 QIAquick 凝胶提取试剂盒(Qiagen,巴伦西亚,加利福 电话号码列表表尼亚州,美国)纯化。引物 CMAH-S1 (5' CCAACCCTGTCATTCCAG 3') 用于对 ZFN 靶向的 CMAH 区域进行测序。修改后的 LDC 的 CMAH 序列的电泳图如图 S2 所示。 CMAH突变细胞上GGTA1基因的破坏和GGTA1-KO细胞的反选择 GGTA1 与 ZFN 破坏和缺乏 Gal 抗原的细胞的反向选择完全按照之前的描述进行8。这些细胞仅根据其表型进行选择,用于 SCNT。仅在从胎儿 收集 DNA 后,才通过 DNA 测序对 GGTA1 破坏进行分析。双敲除过程的其他细节如图 S1 和 S2 所示。 体细胞核移植 体细胞核移植(SCNT)是在体外进行的成熟卵母细胞(DeSoto Biosciences Inc.St Seymour, TN 和 Minitube of America,Mount Horeb, WI, USA)。卵母细胞是从屠宰场的集的。通过移液0.1%透明质酸酶从卵母细胞中去除卵丘细胞。选择具有正常形态和可见极体的卵母细胞,并在含有 5 μg/ml 双苯甲亚胺和 7.5 μg/ml 细胞松弛素 B 的操作培养基(含 5% FBS
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